起发 线性聚乙烯亚胺PEI MW25000

　　1. 接种细胞： 转染前一天，用胶原酶（BIOHUB Cat#78CL10002)消化细 胞并计数。调整细胞浓度，将细胞铺入细胞培养的器皿，每个孔置 入的细胞量应能使转染时细胞汇合度达到 70~80%。

　　2. 准备 DNA-PEI 复合物： DNA、PEI 试剂和稀释剂在进行以下步骤前需先使其升 至室温。依据表 1 所示，用 Opti-MEM ITM或其他适合的无蛋白培 养基稀释适量 DNA。用同样的培养基稀释 PEI 试剂。每 1 μg DNA 需用 1-5 μL 线 性 PEI 转染试剂(这个需要客户自行摸索配比，每一批转染试剂和每一批 DNA 比例可 能会稍有不同）。一边轻轻涡旋装有 DNA 溶液的试管，一边将稀释的线性 PEI 转染 试剂滴加至试管中（注意：请勿颠倒添加顺序）。充分混匀后，室温静置 10~25 min 以形成 DNA-PEI 复合物。当溶液体积较大时，请用圆底聚丙烯管，例如 NEST 5 mL /14 mL 离心管。

　　3. 转染细胞： 直接向每个孔中加入 DNA-PEI 复合物并轻轻涡旋培养板/培养皿。在 无血清条件下转染时，去除生长培养基，替换成无血清培养基，然后滴 DNA-PEI 复合 物。转染 3 h 后，添加?体积的包含 30%血清的生长培养基。

　　4. 孵育细胞和分析结果： 在 CO2 培养箱中 37℃下孵育细胞至可以分析检测。转染 后最快 7 h 即可检测到转入基因的表达。

　　5. 转染 24 h 后，将细胞传代至新鲜的生长培养基中（将细胞稀释 10 倍 以上），在 CO2 培养箱中 37℃孵育过夜。第二天加入与转染抗性基因相匹配的筛选药物。约 1~2 周可 筛选到耐药性克隆，在这期间需经常更换含筛选药物的生长培养基。

　　转染操作流程：(悬浮细胞转染方法)

　　1. 转染前准备：悬浮细胞传代接种于适量含悬浮细胞生长培养基中，合适条件下培养。根据培养瓶大小调整细胞密度（例100mL培养瓶，1X10 6 cells/mL），然后旋紧瓶口放入摇床继续培养，2~4小时后可以进行转染。

　　2. 准备 DNA-PEI 复合物：DNA、PEI 试剂和稀释剂在进行以下步骤前需先使其升至室。用 Opti-MEM ITM或其他适合的无血清培养基稀释适量 DNA。用同样的培养基稀释 PEI 试剂。每 1 μg DNA 需用 1-5 μL 线性PEI转染试剂。一边轻轻涡旋装有 DNA 溶液的试管，一边将稀释的线性PEI转染试剂滴加至试管中（注意：请勿颠倒添加顺序）。充分混匀后，室温静置 10~25 min 以形成 DNA-PEI复合物。当溶液体积较大时，请用圆底聚丙烯管，例如 NEST 5 mL /14 mL 离心管。

　　3. 转染细胞：将PEI-DNA转染复合物逐滴加入到细胞培养液中，摇匀后旋紧瓶口放回摇床合适培养条件下培养至可以分析检测。

　　4. 孵育细胞和分析结果：转染后一般24-72h即可检测到转入基因的表达。 请自行确定适合检测时间。

　　5. 如果要获得更多的蛋白产量，有文献表明转染后24小时，可以适当稀释细胞，稀释比例参考范围（1:1—1:5）之间，可以增加蛋白产量，稀释效应与最佳稀释比率应根据经验确定。

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